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黃酮“落新婦苷”對胰脂肪酶抑製作用研究

發布日期: 2019-01-16 15:40:23

鄭丹,張清峰*

(江西農業大學 食品科學與工程學院,江西省天然產物與功能食品重點實驗室,江西 南昌,330045)

摘 要通過研究落新婦苷對胰脂肪酶的抑製活性,進一步探索其調節脂肪代謝的可能原因。結果表明,落新婦苷對胰脂肪酶有一定的抑製作用,半抑製率濃度為105 μmol/L,最大抑製率為56.3%;且抑製效果隨二者作用時間延長而增強。酶動力學特征研究表明,落新婦苷是胰脂肪酶非競爭性抑製劑,不改變其與底物的親和程度,但使最大反應速度減小。熒光光譜滴定法表明落新婦苷會使胰脂肪酶內源熒光淬滅,並使其最大發射波長紅移,二者結合常數lgKa為5.50,結合位點數n為1.17。

關鍵詞落新婦苷; 胰脂肪酶; 抑製作用

以甘油三酯為主的食物脂肪攝入後,須通過胰和胃脂肪酶水解成單酰甘油和遊離的脂肪酸後才能被吸收。脂肪酶抑製劑通過抑製胰和胃脂肪酶活性,可以減少膳食中脂肪的吸收,並通過糞便直接排泄,從而達到控製和治療肥胖的目的。脂肪酶抑製劑因不影響食欲和人體神經係統,已被證實有較高安全性。因此,從天然植物中尋找安全有效的脂肪酶抑製劑成為預防和治療的肥胖熱點問題[1-2]。研究表明許多黃酮單體或富含黃酮的植物提取物有脂肪酶抑製活性[2-4]

落新婦苷是一種廣泛存在於植物及其加工食品中的功能性黃酮成分,如土茯苓[5]、龜苓膏[6]、葡萄(葡萄酒)[7]、羅漢茶[8]等。碰碰网前期研究發現給高脂小鼠喂食土茯苓總黃酮及落新婦苷單體可顯著減少小鼠體重增幅、腹腔脂肪重量、血清中甘油三酯含量[9]。本文通過研究落新婦苷對胰脂肪酶的抑製活性,進一步解釋其可能的作用原因。

1 材料和方法

落新婦苷由本實驗室從土茯苓中純化,經 UV、IR、MS 和 NMR 鑒定,純度>98%;豬胰脂肪酶,上海晶純生化科技股份有限公司;4-硝基苯棕櫚酸酯(PNPP),上海晶純生化科技股份有限公司;4-硝基苯酚(PNP),上海展雲化工有限公司;阿拉伯樹膠,上海青析化工科技有限公司;脫氧膽酸鈉,上海晶純生化科技股份有限公司;Tris-HCl,北京索萊寶科技有限公司。其他所用試劑均為分析純。

12 試驗主要儀器

HH-6數顯恒溫攪拌循環水箱,常州國華電器有限公司;5600型可見分光光度計, 江蘇晶禾科儀廠;970CRT型熒光分光光度計,上海精密科學儀器有限公司。

13 試驗方法

1.3.1 主要試劑的配製

配製50 mmol/L pH 8.0的Tris緩衝液,並加入0.1%阿拉伯樹膠粉和0.2% 脫氧膽酸鈉。用Tris緩衝液配製1.2 mg/mL的胰脂肪酶溶液,混勻後5 000 r/min離心取上清液。精確稱取22.5 mg落新婦苷用60%乙醇溶解至5 mL,再取1 mL用Tris緩衝液稀釋至10 mL得到1 mmol/L的落新婦苷溶液。底物PNPP先溶於無水乙醇,再用Tris-HCl緩衝液稀釋,最終濃度為0.2 mmol/L,乙醇體積分數為1%。

1.3.2 PNP標準曲線的繪製

精密稱取PNP,用乙醇配成濃度為5 mmol/L的母液,後用Tris緩衝液分別稀釋至0.01、0.025、0.04、0.05、0.075 mmol/L, 測定其在405 nm處的吸光度。以PNP濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪製標準曲線,得到線性方程為Y=16.908X+0.017 5,線性相關係數R2=0.997 4。

1.3.3 最適胰脂肪酶反應體係建立

將胰脂肪酶溶液,底物溶液以及緩衝液在37 ℃水浴中保溫10 min,分別取0.5 mL Tris緩衝液(pH 8.0)和胰脂肪酶溶液,再加入1 mL底物PNPP溶液,混勻後反應不同時間(0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 min),然後在405 nm波長下測定吸光度。以0 min時混合液的吸光度為空白,每組做3個平行,找出最適反應時間。在最適反應時間下,改變緩衝液pH(6.0、7.0、8.0)和水浴溫度(25、37 ℃),找出最適反應溫度和pH。

1.3.4 落新婦苷與胰脂肪酶作用時間對其抑製作用的影響

在37 ℃水浴中保溫10 min後,分別移取0.3 mL Tris緩衝液、0.2 mL落新婦苷溶液、0.5 mL胰脂肪酶溶液於試管中,混勻後在37 ℃水浴中分別靜置0、2、4、6、8、10 min後,再加入1 mL PNPP底物溶液,37 ℃水浴反應20 min後測定405 nm處吸光度A1;將落新婦苷溶液換為緩衝液得到吸光度A2;以加入PNPP後反應0 min時吸光度為A0(空白)。實驗重複3次,取平均值,計算抑製率,如公式(1)所示:

抑製率

(1)

1.3.5 落新婦苷濃度對胰脂肪酶抑製作用的影響

在37 ℃水浴中保溫10 min後,分別移取0.3 mL 緩衝液、0.2 mL不同濃度落新婦苷溶液(0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mmol/L)、0.5 mL胰脂肪酶溶液於試管中,混勻後在37 ℃水浴中靜置10 min,再加入1 mL PNPP底物溶液,在37 ℃水浴中反應20 min後,在405 nm波長下測定其吸光度。按1.3.4計算抑製率,實驗重複3次,取平均值。

1.3.6 落新婦苷抑製胰脂肪酶的動力學特征

在37 ℃水浴中保溫10 min後,分別吸取0.3 mLTris緩衝液、0.2 mL落新婦苷溶液、0.5 mL胰脂肪酶溶液,再加入1 mL不同濃度的底物PNPP溶液(0.05~0.5 mmol/L),37 ℃水浴反應20 min後,測定405 nm吸光度,扣除空白後根據PNP標準曲線,計算PNP生成量,再除以反應時間20 min,得到酶促反應速度,按照Lineweaver-Burk 的雙倒數作圖法,確定抑製作用的類型。

1.3.7 熒光光譜滴定法測定落新婦苷與胰脂肪酶的相互作用

將落新婦苷(0.01 mol/L)用Tris緩衝液稀釋100倍後,分別取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL於5 mL比色管中,再各加入1 mL胰脂肪酶溶液,最後用Tris緩衝液定容至5 mL。搖勻後測定熒光強度,設定激發波長為280 nm,發射波長掃描範圍為280~450 nm,靈敏度為2,激發和發射的狹縫寬度均為10 nm。

1.3.8 數據統計

實驗平行重複3次,取平均值,使用origin 8.0 (Origin Lab Co., Northampton,MA, USA)軟件進行數據統計分析、繪圖和曲線擬合。

2 結果與討論 21 最適胰脂肪酶反應體係建立

胰脂肪酶可以將底物PNPP水解,產物為PNP和棕櫚酸,PNP在405 nm處有最大吸收,因此可以通過測定405 nm處的吸光度反映酶活力。酶促反應速度需要在底物充足的情況下測定,因為在一個封閉的反應體係中,隨著反應時間的增加,底物逐漸被消耗,底物不足會使酶促反應速度逐漸下降。由圖1可知,在0~20 min內吸光度隨時間的延長線性增大,說明在此時間段底物是充足的,酶促反應速度恒定;20 min之後,吸光度的增長速率逐漸減慢,說明底物不充足,酶促反應速度下降。因此選擇反應時間為20 min。

圖1 最適胰脂肪酶反應時間確定

Fig.1 The optimal reaction time of pancreatic lipase

改變反應體係的pH值為6.0、7.0和8.0,實驗結果表明pH值為7.0時反應速度很慢,在pH 6.0時幾乎不反應。當反應溫度設置為25 ℃時,反應速度變得很慢。因此,本實驗的最佳反應體係確定為pH 8.0、37 ℃下反應20 min。

22 落新婦苷與胰脂肪酶作用時間對抑製作用的影響

恒定落新婦苷的濃度為100 μmol/L,圖2為落新婦苷與胰脂肪酶作用不同時間對其抑製作用的影響。結果表明,隨著落新婦苷與胰脂肪酶作用時間的增加,其抑製作用逐漸增強,說明二者的結合需要一定的時間。王詩卉等在研究兒茶素(EGCG)對胰脂肪酶抑製作用時也發現,EGCG與胰脂肪酶剛混合時,抑製作用很差;抑製率隨兩者作用時間的延長逐漸增強[10]。根據圖2,確定落新婦苷與胰脂肪酶作用時間為10 min。

圖2 不同作用時間對胰脂肪酶抑製作用的影響

Fig.2 The effects of interaction time between astilbin and pancreatic lipase on the inhibition rate

23 落新婦苷濃度對胰脂肪酶抑製作用的影響

圖3為不同濃度的落新婦苷對胰脂肪酶的抑製效果。在0~20 μmol/L濃度範圍內,隨著落新婦苷濃度的增加抑製率快速增加;此後繼續增加落新婦苷濃度,抑製率趨於穩定。濃度為120 μmol/L時,落新婦苷對胰脂肪酶的抑製率為56.3%。根據曲線,落新婦苷對胰脂肪酶的半抑製率濃度大約為105 μmol/L。張晨辰等[11]研究發現,100 μmol/L條件下,槲皮素對胰脂肪酶活性的抑製率為65.5%;其他許多黃酮化合物如高良薑精,黃芩素,芸香葉苷等都可有效抑製胰脂肪酶活性,提示黃酮類化合物有可能成為新型的胰脂酶抑製劑。

圖3 落新婦苷濃度對胰脂肪酶抑製作用的影響

Fig.3 The effects of astilbin concentration on the inhibition of pancrelipase

24 落新婦苷抑製胰脂肪酶的酶動力學特征

根據酶與抑製劑相互作用方式,可逆抑製作用有競爭性抑製、非競爭性抑製、反競爭性抑製等3種形式。競爭性抑製是抑製劑與底物競爭與酶活性中心結合從而使酶活性降低, 酶動力學表現為米氏常數(Km)增大,而最大反應速度(vmax)不變。非競爭性抑製指抑製劑與酶活性中心以外的其他部位結合,從而使酶的催化活性降低,酶動力學表現為vmax變小,但Km不變。改變底物PNPP的濃度[S],測定得到有無落新婦苷條件下對應的酶促反應速度v,根據Lineweaver-Burk雙倒數方程,以1/[S]對應1/v作圖,得到圖4。落新婦苷不改變胰脂肪酶與底物的親和程度, 即Km值不變,但vmax減小,說明落新婦苷是胰脂肪酶非競爭性抑製劑。落新婦苷與胰脂肪酶活性中心以外的其他部位結合,這種結合不影響酶活性中心與底物的結合,因此Km值不變,但酶-底物-抑製劑三者複合物不能分解為產物PNP,因此vmax減小。

圖4 落新婦苷抑製胰脂肪酶的Lineweaver-Burk雙倒數方程擬合曲線

Fig.4 Fitting curve of Lineweaver-Burk double reciprocal equation of astilbin inhibition of pancreatic lipase

25 熒光光譜法分析落新婦苷對胰脂肪酶結合作用

胰脂肪酶中含有色氨酸殘基,可以發射熒光。圖5為脂肪酶的熒光發射光譜,脂肪酶的最大激發波長為280 nm,最大發射波長為341 nm。加入落新婦苷會使胰脂肪酶的內源熒光強度有規律的降低,即發生熒光淬滅現象,並使其最大發射波長向長波方向移動至356 nm,說明二者有相互結合作用。可通過公式(2)來計算落新婦苷與落新婦苷之間的結合常數Ka和結合位點數n[13]

(2)

式中F0F分別表示加入落新婦苷前後脂肪酶的熒光強度;Ka為結合常數;cq為落新婦苷的濃度;n為結合位點數。將

與lgcq的進行線性回歸,從而計算Kan。擬合結果如圖6所示,室溫下(約290 K)、落新婦苷與脂肪酶結合常數lgKa為5.50,結合位點數n為1.17。

圖5 落新婦苷對胰脂肪酶熒光光譜的影響

Fig.5 The effect of astilbin on fluorescence emission spectra of pancreatic lipase

注:1~9中落新婦苷質量濃度分別為0,2,4,6,8,10,12,14,16,18 μmol/L

和lgcq線性回歸曲線

Fig.6 The linear graphs of lg

and lgcq

3 結論

黃酮“落新婦苷”對胰脂肪酶有一定的抑製作用,半抑製率濃度為105 μmol/L,最大抑製率為56.3%;且抑製效果隨二者作用時間延長而增強。落新婦苷不改變胰脂肪酶與底物的親和程度,但使其最大反應速度減小,是胰脂肪酶的非競爭性抑製劑。熒光光譜滴定實驗表明落新婦苷可與胰脂肪酶結合,二者結合常數lgKa為5.50,結合位點數n為1.17。本研究結果表明落新婦苷可以抑製胰脂肪酶活性,這可能是其有脂肪代謝調節作用的機製之一。


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